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| Microdissection
Laser LCM |
| Kit d'extraction PicoPure™
DNA |
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Directement à la PCR
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Le kit PicoPure™ DNA permet une extraction
simple et rapide de l'ADN génomique prêt
à l'utilisation en PCR. Extraire et amplifier
l'ADN dans le même tube, sans phase d'extraction
organique ou de centrifugation sur colonne. Récupérer
l'ADN à partir de quelques cellules obtenues
par Microdissection Laser ou de quelques milligrammes
de tissu.
Le kit d'extraction PicoPure™ DNA contient
de la proteinase K stabilisée, un tampon
de reconstitution compatible avec les techniques
de PCR, et un mode d'emploi complet. Dans ce kit,
chaque aliquot de proteinase K peut être
reconstitué fraîchement pour faire
150µl de solution d'extraction, soit 150
x 10µl en utilisant les CapSure™ HS
ou 30 x 50µl en utilisant les Macro CapSure.
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Extraction et amplification
reproductibles d'ADN de gènes simple-copie
à partir de 10 cellules capturées
par LCM. Cellules microdisséquées
à partir de cytospin de cellules blanches
de sang périphérique humain.
Extraction avec 10 µL de PicoPure DNA.
Analyse après 35 cycles de PCR à
l'aide de 3 sets de primers. M: DNA Marker
(Sigma). Couloirs 1-5: 536 bp fragment du
gène de la Béta-globine humaine.
Couloirs 6-10: 245 bp fragment de gène
de la mucoviscidose (CFTR). Couloirs 11-15:
125 bp fragment du gène de la p53.
Couloir 16: pas de template, contrôle
négatif PCR. |
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Augmenter le rendement en ADN
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Comme l'ADN n'est pas perdu lors d'une éventuelle
phase d'extraction organique ou de centrifugation
sur colonne, le kit PicoPure DNA permet un rendement
en ADN fiable et reproductible à partir
de quelques cellules.
Des études en PCR illustrent les avantages
du kit PicoPure DNA. Une quantité équivalente
d'ADN a été transférée
dans un tube pour PCR, à partir d'extractions
faites avec PicoPure DNA, et avec un kit d'un
fabricant leader de ce marché. Une PCR
quantitative en temps réelle (QRT-PCR)
montre que les échantillons traités
par PicoPure DNA s'amplifient plus vite, suggérant
plus de quantité d'ADN de départ,
avec une amplification plus fidèle, indiquant
moins de variations dans les échantillons,
qu'avec une technique classique sur colonne.
Le kit PicoPure DNA permet une récupération
fiable de l'ADN qui augmente le sensibilité
de détection, par exemple, lors de l'amplification
d'un gène en simple copie dans une analyse
de mutations ou lors d'analyses en génotypage.
Ce haut rendement en ADN fait de ce kit, le produit
idéal en utilisation à partir de
petits échantillons microdisséqués,,
telles ceux préparés par LCM.
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Récupération
supérieure d'ADN à l'aide de
PicoPure DNA. 1 ng d'ADN a été
dilué dans 10 µL de PicoPure
DNA, 5 réplicats. La même opération
est réalisée avec d'autres kits
du commerce. Un fragment du gène de
la béta-globine humaine est ensuite
amplifié par RT-PCR, 40 cycles. |
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Extraire de l'ADN pour toutes les applications
en PCR
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| L'ADN extrait avec le
kit PicoPure DNA est compatible avec une utilisation
en PCR dans le même tube de 0,5ml utilisé
pour l'extraction. Pour déterminer le nombre
de copies d'un gène, l'ADN de très
petits échantillons peut êtres amplifié
directement par QRT-PCR sans aucune étape
de purification préalable, en utilisant une
plateforme comme le LightCycler® (Roche) . Pour
des analyses de mutations ou de génotypage
très particulières, l'ADN peut être
extrait à partir de très petits échantillons
et directement amplifié, et les fragments
peuvent êtres séparés par dHPLC
(denaturing High-Performance Liquid Chromatography),
en utilisant un système WAVE® (Transgenomics). |
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Extraction par PicoPure DNA
et quantification du nombre de copies de Her2neuRT-PCR.
10, 100, et 1000 cellules SKBR3 ont été
microdisséquées à partir
d'étalement cellulaire par LCM. L'ADN
est extrait par 10 µL de PicoPure DNA
et 10 µL sont dilués avec 20
µL de solution pour LightCycler®
et amplifiés sans autre purification.
Le nombre de copies de gène par échantillon
est déterminé et divisé
par le nombre de cellules pour avoir le nombre
de copies par cellule. |
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L'extraction PicoPure DNA est
compatible avec la PCR en point final et la
détection d'amplicons par dHPLC. L'ADN
est extrait de 10 cellules blanches de sang
périphérique humain à
l'aide de PicoPure DNA. L'ADN est directement
utilisé sans autre purification pour
amplifier par PCR un fragment de 125 pb du
gène humain de la p53 et un fragment
de 245 pv du gène humain de CFTR. Le
produit PCR est analysé par dHPLC WAVE®
System.
Data courtesy of Scott Hamlin and Nicolas
Neckelmann, Transgenomics, Inc., San Diego,
CA.
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Utilisé avec la plupart des tissus
et préparations cellulaires
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Le kit d'extraction PicoPure DNA permet de récupérer
avec succès l'ADN génomique à
partir de coupes de tissus animal et de la plupart
des préparations cellulaires*. De très
bons résultats sont obtenus à partir
de coupes en paraffines fixation au formol, de
coupes de tissus congelés, de cellules
fixées à l'éthanol, et de
frottis cellulaires.
*N'est pas recommandé pour utilisation
sur sang total, plantes et champignons.
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| PicoPure DNA extraction
and ?-globin gene amplification from LCM samples
prepared by various methods. Cell and tissue
samples were prepared for LCM using the methods
listed below. LCM was used to collect samples.
DNA was extracted using the PicoPure DNA Extraction
Kit, a single-copy 536 bp human ?-globin fragment
was amplified from each sample using standard
protocols, and the products were electrophoresed
on a 10% polyacrlamide/TBE gel and stained
with SYBR® Gold Nucleic Acid Stain (Molecular
Probes). M: DNA marker. Lanes 1-3: ethanol-fixed
SKBR3 cells. Lanes 4-6: formalin-fixed, paraffin-embedded
breast tissue. Lanes 7-9: frozen, ethanol-fixed
foreskin tissue. Lane 10: positive PCR control
of 1 ng human genomic DNA template. Lane 11:
negative control, no PCR template. |
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Pour usage laboratoire uniquement.
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Ferme des Ebisoires, Impasse Paul Langevin, 78370 Plaisir - France
Tél +33 (0)1 30 07 52 95 - Fax +33 (0)1 30 07 51 56 - Email info@alphelys.com
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